吳摘 王新剛 趙振民

　　［摘要］目的 探討建立幼年 SD 大鼠顱骨器官體外培養(yǎng)矢狀縫牽引成骨模型。方法 取 19 的 SD 大鼠顱頂骨矢狀縫組織塊， 10‐³N (0.4g)力，對(duì)照組不加力。培養(yǎng) 24 h 結(jié)束時(shí)，進(jìn)行大體觀(guān)察及倒置顯微鏡下觀(guān)察；并劷蘇木精-伊紅染色后進(jìn)行組織學(xué)觀(guān)察。結(jié)果 大體觀(guān)察及倒置顯微鏡下觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組骨縫逐漸明顯加寬，加排列24 h ，所有標(biāo)本矢狀縫未見(jiàn)斷裂。組織學(xué)觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，縫兩側(cè)區(qū)域?yàn)槌晒腔钴S部位，兩側(cè)骨化前沿交錯(cuò)縫內(nèi)可見(jiàn)纖維結(jié)締組織、成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及毛細(xì)血管，縫內(nèi)組織與硬腦膜相連縫保持正常發(fā)育，未見(jiàn)明顯變化，以成骨細(xì)胞為主。結(jié)論 大鼠顱骨骨縫器官可以在體外培養(yǎng)中成功存活并繼續(xù)生長(zhǎng)。

　　【 關(guān)鍵詞 】 顱縫；器官培養(yǎng)技術(shù)；機(jī)械張力

　　Rat cranial sutures in vitro:a new experimental model for studying the osteogenic to tensile force WU Di,WANG Xin-gang,YIN Ning-bei, ZHAO Zhen-min．Department  of Cleft Lip and Palate,Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100144,China

　　[ Abstract ] objective To develop an in vitro model for cranial suture of neonatal SD rat .Methods  The parietal bones with the sagittal suture were removed from SD rats ( 19-days old ) for organ culture, In the experimental group , tensile force 3 . 92 х10‐³N(0.4g) was applied by helical springs ,whereas no applied tension ( ON ) was set in control group . explants were observed under inverted microscope . At the end of the incubation period for 24 hours , general conditions observed under inverted microscope and histological conditions were observed after hematoxylin and were observed after hematoxylin and eosin stain . Results  Under inverted micrope, sutures had no obviolls changes In control group , whereas sutures were enlarged gradually in the experimental group . With histological observation , sutures developed normally in control group , but in experimental group ,osteohlasts and capillary vessels proliferated actively in the suture . Conclusions In vitro model of cranfa cranial suture can be cultured and grown successfvel.

　?。跭ey words］ Cranial suture; Organ culture techniques；Stress , Mechanical

　　骨縫是顱面骨骼生長(zhǎng)的主要部位，被硬腦膜等組織包繞，位于堅(jiān)硬的骨骼之間。體外實(shí)驗(yàn)是將離體骨縫組織置于培養(yǎng)基中進(jìn)行牽引，這不僅避免了體內(nèi)綜合因素的影響，還可單獨(dú)對(duì)縫組織施加某種條件，以明確它的作用。我們通過(guò)顱骨骨縫器官培養(yǎng)和體外縫牽引技術(shù)，建立幼年大鼠顱骨矢狀縫牽引成骨模型，從而能簡(jiǎn)便客觀(guān)地研究顱縫牽引生物學(xué)變化規(guī)律。

　　材料與方法

　　一、材料

　　1．牽引裝置制備：按照 Hickory 和 Nanda 的方法設(shè)計(jì)螺旋彈簧(HiIckory WB , Nanda R . Effect of tensile force magnitude on release of cranial suture cells into 5 phase . Am J Orthod Dentofac Orthop , 1987 , 91 ( 4 ) : 328-334 .)。應(yīng)用直徑為25 mm 的正畸矯治鋼絲彎制成螺旋彈簧，彈簧體部伸出兩臂，臂分為水平部分和末端向下彎曲 900 的垂直部分。彈簧直徑是 4mm ，圈數(shù)為 6 圈。臂水平部分長(zhǎng)為 50 mm ，垂直部分為 7 mm 。當(dāng)兩臂末端壓縮距離為 7mm 時(shí)即為 3 . 92х10‐³N ( 0 . 49 ）的張力，當(dāng)垂直置人部分用膠布固定時(shí)即為 O N 張力。

　　2 ．動(dòng)物標(biāo)本的切?。哼x用 19 日齡的 sD 大鼠 20 只，由北京維康利華公司提供。術(shù)區(qū)消毒后，在解剖顯微鏡下暴顯顱蓋骨，包括兩側(cè)的頂骨及其間的矢狀縫，其寬為 8 mm ，長(zhǎng)為 10 mm ，保留顱骨外膜和硬腦膜。隨機(jī)分為對(duì)照組（不加力）和實(shí)驗(yàn)組加 3 . 92 X 10‐³N ( 0 . 49 ）力進(jìn)行體外培養(yǎng)（圖 1 ）。

　　二、方法

　　1 ．器官培養(yǎng)：將顱蓋骨標(biāo)本放人裝有無(wú)酚紅高糖型 Dulbecco 改良 Eagle 培養(yǎng)基（ DMEM ）的培養(yǎng)皿中，在 37 °C 、 5 ％的 CO2 ：孵育箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基中加入10%的牛頜血，青霉素，鏈霉素。于24 h 收集組織標(biāo)本。

　　2 ．組織學(xué)處理：將培養(yǎng) 24h 的標(biāo)本置于 10 % 中性甲醛溶液中固定 10h 后，用乙二胺四乙酸 ( EDTA ）脫鈣液（由中杉金橋試劑公司提供）脫鈣 10d ，常規(guī)脫水，石蠟包埋，制作 4μm 厚的切片。
 
3 ．蘇木精一伊紅（ HE ）染色：蘇木精染液浸泡 3～4min ，流動(dòng)自來(lái)水沖洗； 1 ％鹽酸乙醇分化數(shù)秒，流動(dòng)自來(lái)水沖洗； 1 ％氨水顯藍(lán) 30s 1 min ，流動(dòng)自來(lái)水沖洗后鏡檢；伊紅染色 40s，流動(dòng)自來(lái)水沖洗 30s ；置于 75 ％乙醇中 20s ; 95 ％乙醇中 l～Zmin ，共 2 次；無(wú)水乙醇中 1～Zmin ，共 2 次；置于二甲苯工中 2min ，二甲苯 11 中 2min ；中性樹(shù)膠封片。

　　結(jié)果

　　一、大體觀(guān)察

　　大鼠顱骨標(biāo)本劷體外培養(yǎng) 24h 后，標(biāo)本未見(jiàn)壞死。對(duì)照組骨縫未見(jiàn)明顯變化。實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用彈簧進(jìn)行縫牽引后，骨縫逐漸加寬，加力 24h 有標(biāo)本矢狀縫未見(jiàn)斷裂。

　　二、倒置顯微鏡下觀(guān)察于低倍倒置顯微鏡下觀(guān)察，培養(yǎng)液未見(jiàn)細(xì)菌污染，顱骨標(biāo)本未見(jiàn)壞死。對(duì)照組骨縫未見(jiàn)明顯變化。實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用彈簧牽引后，骨縫逐漸加寬，加力 24h ，所有標(biāo)本矢狀縫未見(jiàn)斷裂，與大體觀(guān)察相吻合（圖 2 ）。 

　　三、組織學(xué)表現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本骨縫明顯增寬，縫兩側(cè)區(qū)域?yàn)槌晒腔钴S部位，兩側(cè)骨化前沿交錯(cuò)排列。縫內(nèi)可見(jiàn)纖維結(jié)締組織、成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及毛細(xì)血管，縫內(nèi)組織與硬腦膜相連；兩側(cè)骨化前沿可見(jiàn)有成骨樣細(xì)胞，說(shuō)明不斷有新骨形成。對(duì)照組標(biāo)本骨縫保持正常發(fā)育，以成骨細(xì)胞為主。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均未見(jiàn)組織壞死（圖 3 ）。

　　討論

　　在正常生理狀態(tài)下，顱面骨縫處于幾種力的綜合作用下，大致分為壓力、拉力及切應(yīng)力。張力的產(chǎn)生主要來(lái)自于生長(zhǎng)中的腦組織，它對(duì)顱頂產(chǎn)生向外的作用力。對(duì)于顱頂內(nèi)表面及其骨縫而言是一種壓力，促進(jìn)骨吸收；而對(duì)于外表面及其骨縫又是一種拉力，促進(jìn)骨形成。這兩種力綜合作用的結(jié)果便使顱骨容積增大(Sun Z , Lee E , Herring SW . Cranial SutureS and bones : growth and fusion in relation to masticatory strain . Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol , 2004 , 276 ( 2 ) : 150- 161 .)?？梢赃@樣認(rèn)為，骨縫使顱骨縱向生長(zhǎng)，如果沒(méi)有骨縫，顱骨將只能增厚。張力還可產(chǎn)生于咀嚼肌，它通過(guò)鄰近的骨傳遞給縫，既可表現(xiàn)為拉力，也可表現(xiàn)為壓力。除此以外，有報(bào)道認(rèn)為顱面骨縫還受到切應(yīng)力的作用［ Rafferty KL , Herring SW , Marshall CD . BiomechanicS of the rostrum and the role of facial Sutures . J Morphol , 2003 , 257 ( 1 ) : 33-44 . ］。由于其檢測(cè)技術(shù)復(fù)雜，切應(yīng)力一般并不單獨(dú)用于骨縫的研究。但我們應(yīng)該考慮到，在對(duì)骨縫施加拉力或壓力時(shí)，切應(yīng)力可能會(huì)隨之產(chǎn)生，這將影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

　　幾乎所有的顱面骨縫都曾被用于張力研究［ Alaqeel SM , Hinton RJ , opperman IA . Cellular response to force application at craniofacial sutures . Orthod Craniofacial Res , 2006 , 9 ( 3 ) : 111-122 . ］。本實(shí)驗(yàn)選擇顱骨矢狀縫為研究對(duì)象。對(duì)于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，矢狀縫和冠狀縫較為常用，因?yàn)樯项M骨在矯正顱面部畸形中的重要作用，對(duì)其周?chē)强p的研究也很多。選擇骨縫一個(gè)很重要的原則應(yīng)是易于獲取，覆蓋顱骨矢狀縫的軟組織血供少，又無(wú)肌肉附著，遠(yuǎn)離口鼻區(qū)域，切取標(biāo)本及培養(yǎng)時(shí)不易被污染機(jī)械張力對(duì)顱面骨縫作用的實(shí)驗(yàn)研究主要分為體內(nèi)及體外兩種。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)是對(duì)不同動(dòng)物的骨縫施加直接或間接張力，觀(guān)察受力后縫的變化情況。其中間接張力可以來(lái)自縫周?chē)难例X或肌肉，通過(guò)改變牙齒或肌肉的力量間接影響骨縫的受力程度［Byron CD , BorkeJ , Yu J , et al . Effects of increased muscle mass on muouse sagittal suture morphology and mechanics . Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Blol , 2004 , 279 ( 1 ) : 676-684 .Hamrick MW , Samaddar T , PenningtonC , et al . Increased muscle mass with myostatin deficiency improves gains in bone strength withe 父 ercise . J Bone Miner Res , 2006 , 21 ( 3 ) : 477- 483〕 。先前的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，加力系統(tǒng)力值通常在作用于被研究的顱面骨縫之前測(cè)量，由于顱面結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，在加力系統(tǒng)作用于顱面骨縫時(shí)，有部分力作用于顱面骨縫之外的其他結(jié)構(gòu)。

　　因此，很難通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究力的變化和組織學(xué)反應(yīng)之間的相關(guān)性，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究不能真實(shí)反映骨縫受外力作用后的骨改建情況。體外實(shí)驗(yàn)是將離體骨縫組織置于培養(yǎng)基中進(jìn)行牽引，這避免了骨縫周?chē)M織和全身因素的影響。本實(shí)驗(yàn)采用體外研究方法。自制螺旋彈簧，以顱縫為中心，兩側(cè)正中打孔安置彈簧，孔距 7 mm 。當(dāng)彈簧壓縮為 7 mm 時(shí)產(chǎn)生 3 . 92xl0³ N ( 0 . 4g）張力，這樣控制彈簧力的大小和方向，避免旋轉(zhuǎn)。

　　對(duì)骨縫施加張力后，內(nèi)部細(xì)胞數(shù)量和活性都會(huì)隨之改變。成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的比例將決定較終發(fā)生合成還是分解反應(yīng)。當(dāng)骨縫受拉力作用，成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和毛細(xì)血管均增加；成纖維細(xì)胞對(duì)力大小的變化也很敏感，隨著力值的增加，成纖維細(xì)胞的數(shù)量也會(huì)增加；力的作用時(shí)間及大小對(duì)骨祖細(xì)胞都會(huì)產(chǎn)生作用，較大的張力在初期會(huì)使細(xì)胞數(shù)量增加，隨后會(huì)迅速減少。而以較小的張力持續(xù)作用于骨縫也會(huì)使骨祖細(xì)胞增加。骨縫受到壓力作用會(huì)產(chǎn)生相反的效果，破骨細(xì)胞增加，破骨活性強(qiáng)于成骨活性，引起分解反應(yīng)。在機(jī)械張力的作用下，主要由骨縫中的成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，包括月轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（ TGF 一因、胰島素生長(zhǎng)因子 (TGF-β ）、成骨蛋白（ BMP ）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 ( bFGF ）等(Maxson R , lshii M . The Bmp pathway in Skull vault development . Front Oral Biol , 2008 , 12 : 197-208 . H irukawaK , MiyazawaK , MaedaH , et al , Effect of tensile force on the expression of IGPI and IGF-1 receptor in the organcultured rat cranial suture . Arch Oral Biol , 2005 , 50 (3)：367-372 . Song HM , Fong KD , Nacamuli RP , et al . Mechanisms of murine cranial suture patency mediated by a dominant negative transforming growth factorbeta receptor adenovirus . Plast Reconstr Surg , 2004 , 113 ( 6 ) : 1685-1697 .)，它們通過(guò)自分泌和旁分泌調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的活性。
組織學(xué)分析是反映骨縫生長(zhǎng)發(fā)育的一個(gè)實(shí)用指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕M織學(xué)觀(guān)察是：對(duì)照組標(biāo)本骨縫保持正常發(fā)育，以成骨細(xì)胞為主。實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本骨縫明顯增寬，縫內(nèi)成骨細(xì)胞活躍，毛細(xì)血管增生。未見(jiàn)組織壞死和細(xì)菌感染。提示骨縫器官能在體外培養(yǎng)中存活并能繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育，證明本模型建立成功.骨縫器官培養(yǎng)與細(xì)胞培養(yǎng)相比更接近于機(jī)體內(nèi)的生長(zhǎng)情況，體外器官培養(yǎng)在機(jī)械張力對(duì)顱面骨縫成骨作用的研究中有實(shí)用價(jià)值。

　　綜上所述，骨縫是一種獨(dú)特的組織，它可以向成骨細(xì)胞及成纖維細(xì)胞分化，成骨細(xì)胞分泌骨基質(zhì)，而成纖維細(xì)胞對(duì)其有抑制作用，從而維持縫的穩(wěn)定。當(dāng)施加機(jī)械刺激時(shí)，在多種細(xì)胞因子的參與下，兩種細(xì)胞重新達(dá)到平衡，或者促進(jìn)骨形成，或者引起骨吸收。今后我們將在細(xì)胞水平、分子水平及基因水平研究骨縫的機(jī)械傳導(dǎo)通路，以便能以較適合的機(jī)械刺激指導(dǎo)臨床治療。