作者：劉彥春　　曹誼林　商慶新　夏萬堯　鐘偉

　　關(guān)鍵詞： 聚羥基乙酸；軟骨細胞；體外培養(yǎng)；組織缺損修復

　　【摘要】　目的　在有免疫力的動物兔體內(nèi)探索組織工程化軟骨對軟骨缺損的修復能力。方法軟骨細胞種于經(jīng)不同物質(zhì)修飾的聚羥基乙酸支架體外培養(yǎng)后修復兔耳廓軟骨缺損，與對照組比較，并從大體及組織學進行評價。結(jié)果　軟骨細胞種于經(jīng)不同物質(zhì)修飾的聚羥基乙酸支架體外培養(yǎng)后回植到兔耳廓軟骨缺損部位，軟骨缺損得到修復，但與正常軟骨交界處為纖維組織。注射軟骨細胞懸液、以聚羥基乙酸支架修復及空白對照組軟骨缺損均未修復。結(jié)論　軟骨細胞種于經(jīng)不同物質(zhì)修飾的聚羥基乙酸支架體外培養(yǎng)后在有免疫力的動物兔體內(nèi)可修復耳廓軟骨缺損，但存在著界面愈合問題。

Repair of rabbit auricular defects using chondrocyte-scaffolding constructs

LIU Yanchun, WANG Wei, CAO Yilin, et al.Deparment of Plastic Surgery, Ninth People's Hospital of Shanghai， Shanghai Second Medical University, Shanghai 200011

　　【Abstract】Objective To evaluate if the tissue-engineered cartilage can repair the auricular defects in rabbits that have inherent immunity.Methods Rabbit auricular defects were repaired using chondrocyte-PGA constructs cultured in vitro. The gross and histological comparisons were made between the experimental and the control groups.Results The rabbit auricular defects were repaired with chondrocyte-PGA constructs, leaving fibroid tissue in the interface between the tissue-engineered cartilage and the normal cartilage.Conclusion The auricular defects can be repaired by chondrocyte-PGA in vitro cultured constructs in animals like rabbits that have acquired immunity. The interface healing problems need further study.

　　【Key words】 Polyglycolic acid Chondrocytes In vitro culture Repair of tissue defect

　　目前有關(guān)組織工程化軟骨的形成及其應用研究大部分是在無免疫力的裸鼠體內(nèi)進行［1］，組織工程技術(shù)要過渡到臨床應用，必須完成由低等動物向高等動物的過渡。我們在有免疫力的動物兔體內(nèi)形成組織工程化軟骨的基礎(chǔ)上進一步探討利用組織工程技術(shù)修復兔耳廓軟骨缺損，為臨床應用奠定基礎(chǔ)。

　　1　材料與方法

　　1.1　聚羥基乙酸支架的表面修飾　將直徑15μm、纖維間隔150～200μm、厚度100μm的聚羥基乙酸(Polyglycolic acid,PGA)無紡網(wǎng)(DAVIS-GECK公司提供)以2%的聚乳酸二氯甲烷溶液包埋固定再分別以1%的卵磷脂無水乙醇溶液及10%多聚賴氨酸包埋，以75%酒精浸泡及紫外線照射消毒后保存于干燥器內(nèi)備用。

　　1.2　軟骨細胞懸液制備［2］　新西蘭大白兔24只(體重2.0～2.5kg,雌雄不限)隨機分成：實驗組8只，對照Ⅰ組8只，對照Ⅱ組4只，對照Ⅲ組4只。全麻下將實驗組和對照Ⅰ組計16只兔一側(cè)耳廓從根部切下，剝?nèi)テつw及軟骨膜，剪成0.1cm×0.1 cm大小的碎片，以磷酸鹽緩沖液(PBS，含青霉素200U/ml，鏈霉素200μg/ml)沖洗兩遍，以去除殘余血跡。然后加入兩倍于軟骨體積的Ⅱ型膠原酶(3mg/ml)在37℃恒溫振蕩器內(nèi)消化。4～5h收獲細胞一次，2～3次后軟骨碎片完全溶解，細胞從基質(zhì)中釋放出來。經(jīng)過濾、漂洗、計數(shù)制成細胞懸液，濃度為5×107個/ml。

　　1.3　培養(yǎng)液用F-12培養(yǎng)基加入10%的小牛血清及青霉素100U/ml，鏈霉素100μg/ml。

　　1.4　細胞支架復合物體外培養(yǎng)　將制得的PGA支架裁剪成1.5cm×2.0cm大小，計16個，其中8個分別加入實驗組8只兔各自軟骨細胞懸液250μl，然后將細胞支架復合物分別置于60mm培養(yǎng)皿中，放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱中，4h后加入F-12培養(yǎng)液5ml，抗壞血酸50μg/ml，人轉(zhuǎn)化生長因子-β110ng/ml,人堿性成纖維細胞生長因子2ng/ml。培養(yǎng)液每3天更換一次。定期在倒置顯微鏡下觀察細胞與支架的吸附、生長繁殖及基質(zhì)產(chǎn)生情況。

　　1.5　軟骨缺損的修復　于實驗組、對照I組另一側(cè)耳廓及對照Ⅱ、Ⅲ組雙側(cè)耳廓軟骨根部形成1.5cm×2.0cm大小的軟骨缺損。修復方法見表1，實驗組以體外培養(yǎng)1周的自身軟骨細胞-PGA支架復合物修復；對照Ⅰ組以自身單純軟骨細胞懸液注射修復；對照Ⅱ組單純PGA支架修復；對照Ⅲ組為空白對照。3個月后對所有缺損進行大體觀察及組織學檢測。

　　2　實驗結(jié)果

2.1　細胞支架復合物體外培養(yǎng)期間觀察　培養(yǎng)期間倒置顯微鏡觀察及掃描電鏡檢測見軟骨細胞吸附在支架纖維表面，在支架纖維之間有較多呈蜘蛛網(wǎng)樣分布的基質(zhì)產(chǎn)生(圖1)。

圖1　軟骨細胞-PGA支架復合物體外培養(yǎng)，細胞吸附在支架纖維表面，有呈蜘蛛網(wǎng)樣分布的基質(zhì)產(chǎn)生

　　Fig 1　 The culture of chondrocytes-PGA constructs in vitro, demonstrating the chondrocytes absorbed on the surface of PGA fibers and produced enormous cobweboid matrices (Indicated by black arrow, scanning electron microscope ×600)

　2.2　軟骨缺損修復觀察　3個月后對24只兔32個耳廓軟骨缺損的修復情況大體觀察見圖2，3。組織學檢測證實實驗組軟骨缺損被再生的組織工程化軟骨組織修復，其中PGA支架已完全降解吸收，再生的組織工程化軟骨與周圍軟骨之間可見纖維組織連接(圖4)。對照Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組軟骨缺損為纖維組織修復。

　　3　討論

　　3.1　軟骨損傷或疾病后自發(fā)修復能力有限，目前常用的異體軟骨移植存在著供體匹配、組織保存、供體不足、感染機會增加及傳播疾病等問題；自體軟骨移植可造成供區(qū)損傷，同時也存在著來源受限的問題；使用人工合成生物材料存在著許多潛在的危險和并發(fā)癥，如感染、外露、斷裂、植入體的松脫及與宿主免疫系統(tǒng)的反應都限制了它們的使用。 

　　圖2　以體外培養(yǎng)的軟骨細胞-PGA支架復合物修復的兔耳廓軟骨缺損大體觀，缺損被軟骨組織修復(↑)，組織工程化軟骨與正常軟骨之間可見纖維組織連接.

　　Fig 2 The gross experimental specimen,noting the repair of the rabbit auricular defect by means of chondrocyte-PGA constructs cultured in vitro and the defect repaired by newly generated cartilage (Indicated by black arrow) 

　　圖3　三個對照組兔耳廓軟骨缺損修復大體觀，缺損表面覆有纖維組織，軟骨缺損仍存在(↑)

　　Fig 3 The gross control specimen, noting the repair of rabbit auricular defects in three control groups and the existence of cartilage defects covered with fibrous connective tissues

圖4　以體外培養(yǎng)的軟骨細胞-PGA支架復合物修復的兔耳廓軟骨缺損組織學照片，組織工程化軟骨與正常軟骨之間嵌有纖維組織(↑，HE染色 ×10)

Fig 4　Histological photography of rabbit auricular defects repaired by chondrocyte-PGA constructs cultured in vitro, demonstrating the existence of fibrous connective tissues between the tissue-engineered cartilage and the original cartilage (Indicated by black arrow, HE ×10)

　　3.2　近年興起的組織工程技術(shù)為軟骨缺損的修復開辟了一條新的途徑。目前已在裸鼠體內(nèi)形成了軟骨、骨和肌腱組織；按人耳廓形態(tài)形成復雜的軟骨結(jié)構(gòu)也有報道［3］，并已利用組織工程化軟骨進行替代鼻中隔軟骨、關(guān)節(jié)軟骨及氣管軟骨的應用研究。但上述實驗大部分是在無免疫力的裸鼠體內(nèi)進行。組織工程技術(shù)要過渡到臨床應用，必須完成由低等動物向高等動物的過渡。

　　3.3　我們通過將兔耳廓軟骨細胞種于經(jīng)修飾的PGA支架上回植到兔體內(nèi)后形成了軟骨組織，進一步探討了組織工程化軟骨在有免疫力的動物體內(nèi)對軟骨缺損的修復能力。實驗證明將軟骨細胞種于經(jīng)修飾的PGA支架上體外培養(yǎng)后對軟骨缺損具有修復能力，其中組織工程化軟骨形成的關(guān)鍵在于軟骨細胞與PGA體外培養(yǎng)期間有大量的基質(zhì)產(chǎn)生。但再生軟骨與正常軟骨之間存在著界面愈合問題，可能由于組織工程化軟骨在體內(nèi)形成需要一定時間，在這段時間里纖維組織嵌插于組織工程化軟骨與正常軟骨之間，影響了組織工程化軟骨與正常軟骨之間的愈合，尚有待進一步研究；單純注射軟骨細胞懸液，因軟骨細胞無附著的錨基，細胞注射到體內(nèi)后迅速流失，且不易存活，所以無軟骨組織形成［4］。另外因無形成軟骨的細胞來源及軟骨再生能力有限，所以單純PGA修復組及空白對照組軟骨缺損均未修復。

　　參考文獻

　　1　Vacanti CA, Upton J.Tissue-engineered morphogenesis of cartilage and bone by means of cell transplantation using synthetic biodegradable polymer matrices. Clin Plast Surg, 1994, 21:445-462.

　　2 Klagsbrum M. Large-scale preparation of chondrocytes. Methods Enzymol, 1979, 58:560-564.

　　3　Cao YL, Vacanti JP, Paige KT, et al. Transplantation of chondrocytes utilizing a polymer-cell construct to produce tissue-engineered cartilage in the shape of a human ear. Plast Reconstr Surg, 1997; 100:297-302.

　　4 Atala A, Mooney DJ, Vacanti JP, et al. Synthetic biodegradable polymer scaffolds. Boston:Hamilton Printing Co, 1997:51-83.